第一种高度可扩展的方法来监测蛋白质水平和定位

到目前为止，科学家通常通过使用荧光标签一次标记并跟踪一种蛋白质来研究蛋白质的变化及其在细胞中的作用。这种方法限制了可以研究的蛋白质数量，并排除了无偏见的发现方法。奥地利科学院分子医学研究中心CeMM的研究人员现已开发出一种高度可扩展的方法，该方法可并行研究数百种蛋白质，以监测其水平和细胞内定位的变化。这种新颖的策略不仅对未来针对癌症等疾病的药物开发，而且对我们对蛋白质组动力学的一般理解和认识都做出了显着贡献。他们的发现现已发表在著名的科学杂志上基因组研究。

蛋白质是细胞中的大分子，是人体组织和器官的结构，功能和调节所必需的。它们几乎负责细胞生命的每项任务，并且可以随着它们所服务的功能而多样化。蛋白质水平及其在细胞内的定位调节许多细胞进程的重要方面，并可能成为药物治疗的重要目标。例如，可以通过治疗性干预，通过影响细胞中蛋白质产生和降解的药物来增加或减少蛋白质的丰度。蛋白质也可以在不同的细胞区室之间移动，从而改变其功能。其他蛋白质可能会响应外部刺激而结合到不同的位置，例如发生DNA损伤的区域。

传统上，科学家使用荧光标签标记单个蛋白质并研究其在细胞中的作用。绿色荧光蛋白(GFP)与他们想要研究的某种蛋白质的末端融合在一起。然后，这种蛋白融合物在细胞中表达，通过荧光显微镜，他们可以观察到表达标记蛋白的细胞。该方法允许以时间分辨的方式研究单个蛋白质的许多扰动，例如不同的药物剂量。相反，质谱不适合以无偏见的方式在特定时间点以高可扩展性水平研究和监测蛋白质组(蛋白质的整个补体)上的这些细胞扰动。

CeMM首席研究员Stefan Kubicek小组的Andreas Reicher和Anna Koren开发了一种新颖的策略，该方法首次使人们可以并行观察和表征大量蛋白质中的这些变化。该方法不仅可以用来描述和更好地了解某些已知药物在细胞中的作用，而且可以发现通过影响和调节细胞中蛋白质水平或定位来起作用的新药物治疗方法。

CeMM研究人员设计了一种方法来克服基于CRISPR-CAS9的内含子标签中的瓶颈：需要开发一种方法可以对整个蛋白质组或其中的很大一部分发光，而不仅仅是对蛋白质组的一种蛋白质发光。时间。为了克服这个问题，CeMM研究人员设计了一种生成包含数百种标记蛋白的细胞池的方法，并且在每个细胞中，不同的蛋白都用GFP标记。这些细胞池暴露于BRD4的PROTAC化学降解剂中，后者是在胚胎发生和癌症发展过程中起关键作用的转录调节因子。

研究人员随后使用延时显微镜观察了细胞池中任何标记蛋白的水平或亚细胞定位是否发生了变化，以应对应用的治疗。重要的是，他们应用了CRISPR-Cas9标记策略，然后使他们能够通过使用整个细胞池的原位测序来鉴定哪些蛋白质改变了定位。因此，他们确认了这些药物的已知靶标，但也发现了意料之外的变化。特别是对于BRD4信号的扰动，他们能够报告六个蛋白质的定位变化，这些变化以前未被其他任何高通量方法所识别。最后，他们还表明，该方法揭示了对批准的抗癌药甲氨蝶呤治疗反应的预期和新颖的蛋白质定位变化。

CeMM首席研究员Stefan Kubicek解释说：“我们的研究不仅描述了一项技术，该技术不仅首次将内含子标签应用于基因库，而且在所有三个步骤(内含子标签，细胞成像和原位测序)中均进行了优化。 —从而以最有效的方式实现该过程该方法应用于化学文库和候选分子的功能特别强大，可以开发和深入表征药物，包括诱导和抑制蛋白质相互作用，化学降解以及所描述的策略。加速 的发现，对全球和亚细胞蛋白质组动力学的研究具有重大影响。”

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