想象一下，直接在你的目标基因组的任何位点创造一个突变，而不是筛选成千上万的随机突变体！CRISPR/Cas9系统就是这么做的。在传统形式中，这种正向遗传方法从开始到基因组突变需要七个步骤。然而，有一种方法可以用更少的步骤获得设计者的基因组。使用Cas9核糖核蛋白转化方案，您可以通过较少的前期工作获得您的设计基因组。

经典的CRISPR/Cas9协议

“经典的”cas9基因组工程方案包括以下步骤：

使用基因调控元件(启动子和终止子)、单通道RNA (sgRNA)基因和抗生素基因(也有自己的启动子)等。)以产生含有cas9基因的质粒。

将这个质粒导入你的细胞。

质粒被整合到基因组中(通过非同源终止、同源重组或作为质粒储存)

质粒上的三个基因(cas9、sgRNA、抗生素抗性)被表达。

Cas9和sgRNA形成核糖核蛋白(RNP)复合物。

RNP在基因组中寻找特定的位置，在那里它将产生双链断裂。

双链断裂被修复，那个位置经常发生错误，可能导致移码突变，扰乱你的蛋白质序列。干得好！

核糖核蛋白转换协议

哟，那可是一大堆台阶啊！我想倡导一个方案，减少：核糖核蛋白转化的这些步骤。工作少，问题少！这将删除上述7个步骤中的4个。

要做RNP变换，你需要三个要素3360

Cas9重组蛋白

纯化的sgRNA

靶细胞

Cas9蛋白是商业上可获得的。这可能要花你20美元。可以化学合成sgRNA，但是还是很贵。更明智的做法是订购合成的DNA寡核苷酸，然后用商业试剂盒在体外转录它们。一旦你有了这些成分，将它们混合在一起形成一种化合物。然后，将复合体转移到你的细胞中。人们通常使用电穿孔，但生物岩石轰击或其他物理方法也有效。

RNP的优势和劣势

RNP变换最大的优点是不依赖于细胞的表达机制。你不需要一个好的推广人。你不需要任何东西整合到基因组中。另一方面，选择可能很棘手。最初的研究剔除了具有可选择或可确定表型的基因(如硝酸还原酶、色氨酸合成酶或色素基因)，但抗生素抗性基因的协同转化也取得了一定的成功。

另一个很大的优势是你没有可继承的cas9表达式。突变的cas9蛋白在细胞中迅速降解或稀释。这意味着场下的分裂机会更少了。如果基因组中没有外源DNA，最终的生物体甚至可以被归类为非转基因生物。但是，你为这些优势付出的代价是，cas9的降解速度可能太快，以至于找不到目标位置——，而且要搜索的基因组很多，所以一个蛋白质找到目标位置可能需要几个小时。

最后，另一个缺点是成本。RNP转化比质粒转化更昂贵。与其让质粒在实验室廉价繁殖，不如购买重组蛋白，定期补充sgRNA的存量。

为什么用RNP？

在某些情况下，RNP转换可能是你唯一的选择。例如，如果你没有好的(或足够的)推广人员或精选代理。然而，即使你有一个很好的模式生物，也值得考虑使用RNP方法来节省克隆成本，避免非目标突变，最终获得一个非转基因生物。