想象一下直接在你的目标基因组的任何一个位点上创造一个突变，而不是筛选成千上万的随机突变体!CRISPR/Cas9系统就是这样做的。在传统形式下，这种正向遗传学方法从开始到突变基因组需要7个步骤。然而，有一种方法可以在更少的步骤中获得设计师的基因组。使用Cas9核糖核蛋白转化协议，你可以用更少的前期工作获得你的设计基因组。

一个经典的CRISPR/Cas9协议

一个“经典”的cas9基因组工程协议包括以下步骤:

利用基因调控元件(启动子、终止子)、单导RNA (sgRNA)基因、抗生素基因(也有其自身的启动子等)创建一个包含cas9基因的质粒

把这个质粒转化成你的细胞

质粒被整合到基因组中(通过非同源端接、同源重组，或者作为质粒保存)

质粒上的3个基因(cas9, sgRNA，抗生素抗性)被表达

Cas9和sgRNA形成核糖核蛋白(RNP)复合物

RNP搜索基因组的特定位置，在那里它会产生一条双链断裂

双链断裂被修复，经常在那个部位出现错误，这很可能导致移码突变，扰乱你的蛋白质序列。太棒了!

核糖核蛋白转换协议

唷，那是很多步骤!我想提倡一种协议来减少这些步骤:核糖核蛋白转化。工作少了，出问题的事情也少了!这就去掉了以上7个步骤中的4个。

要做RNP变换，你需要3个要素:

cas9重组蛋白

纯化sgRNA

靶细胞

cas9蛋白在商业上是可用的。这可能要花费你20美元。你可以用化学方法合成sgRNA，但这仍然非常昂贵。更明智的做法是订购合成的DNA寡核苷酸，然后在体外用商业试剂盒进行转录。一旦你有了这些成分，把它们混合在一起形成一个复合物。然后，将复合物转移到你的细胞中。人们通常使用电穿孔，但生物岩轰击或其他物理方法也起作用。

RNP利弊

RNP转化的最大优点是不依赖于细胞的表达机制。你不需要一个好的推广人。你不需要任何东西被整合到基因组中。另一方面，选择可能很棘手。最初的研究已经淘汰了具有可选择或可定形表型的基因(如硝酸盐还原酶、色氨酸合成酶或色素基因)，但抗生素抗性基因的协同转化也取得了一些成功。

另一个很大的优点是你没有可遗传的cas9表达式。引起突变的cas9蛋白在细胞中迅速降解或稀释。这就意味着有更少的机会在场外的乳沟。如果基因组中没有外来DNA，最终的生物体甚至可以被归类为非转基因生物。然而，你为这些优势所付出的代价是，cas9的降解速度可能太快，以至于它找不到目标位置——而且有很多基因组需要搜索，因此一个蛋白质要找到目标位置可能需要几个小时。

最后，另一个缺点是成本。RNP转化比质粒转化更昂贵。与其让质粒在实验室里廉价繁殖，不如购买重组蛋白，定期补充sgRNA的库存。

为什么使用RNP ?

在某些情况下，RNP转换可能是您唯一的选择。例如，如果你没有好的(或足够的)促销员或选择代理人。但是，即使你有一个建立得很好的模型生物体，也值得考虑使用RNP方法来节省克隆费用，避免非目标突变，并最终得到一个非转基因生物。