想象一场战争中，你的敌人数量远远超过一个完全无情的敌人 - 攻击你就是它的全部。另一部终结者电影的介绍?不，只是细菌和古细菌等微生物的另一天，它们面临着来自病毒和入侵的核酸链的永无止境的攻击。为了在这种冲击中存活下来，微生物部署了多种防御机制，包括基于遗传因素的自适应型核酸免疫系统，该遗传因素称为CRISPR，代表Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats。

通过结合CRISPR和相关的“Cas” - 蛋白质小球，微生物能够利用小的定制RNA分子来沉默侵入者遗传信息的关键部分，并在未来获得类似入侵的免疫力。为了更好地了解这种微生物免疫系统的工作原理，科学家们需要更多地了解CRISPR定制的小RNA分子是如何产生的。答案现在由劳伦斯伯克利国家实验室(伯克利实验室)和加州大学伯克利分校的一组研究人员提供。

在生物化学家Jennifer Doudna领导的一项研究中，研究小组利用伯克利实验室先进光源的蛋白质晶体学光束生成了一种称为“Csy4”的内切核糖核酸酶的原子级晶体结构模型。Doudna和她的同事已经将Csy4鉴定为原核生物中的酶，该酶启动了CRISPR衍生的RNA(crRNA)的产生，这是一种靶向和沉默入侵病毒和质粒的小RNA分子。

“我们的模型显示来自同一CRISPR / Cas亚家族的Csy4和相关的内切核糖核酸酶利用精确的识别机制来区分crRNA与其他细胞RNA，以确保选择性产生crRNA以获得细菌获得性免疫，”Doudna说。“我们还发现了Cys4和Dicer中RNA识别机制之间的功能相似性，这种酶在真核RNA干扰中起关键作用。”

Doudna是RNA分子结构的权威机构，与伯克利实验室的物理生物科学部和加州大学伯克利分校细胞生物学系和化学系共同任命。她还是霍华德休斯医学研究所(HHMI)的调查员。这项关于CRISPR的最新研究的结果发表在Science杂志的一篇题为“CRISPR核酸内切酶的序列和结构特异性RNA加工”的论文中。与Doudna共同撰写论文的有Rachel Haurwitz，Martin Jinek，Blake Wiedenheft和Kaihong Zhou。

CRISPR是DNA的一个单元，通常位于微生物的染色体上，由“重复”元件组成，碱基对序列长度为30至60个核苷酸，由“间隔”元件隔开，可变序列也为30至60个核苷酸的长度。在其基因组已被测序的所有细菌的约40%中发现CRISPR单元，并且约90%的古细菌。微生物可能在其基因组内具有几个CRISPR基因座，并且每个基因座可能包含4到100个CRISPR重复 - 间隔区单元。Doudna和她的同事在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中研究了CRISPR，铜绿假单胞菌是一种在环境中普遍存在的常见细菌。

Rachel Haurwitz是Doudna研究小组的研究生，也是科学论文的第一作者，他解释了CRISPR / Cas免疫系统的工作原理。

“当一种细菌识别出它已被病毒或质粒侵入时，它将一小段外源DNA整合到其中一个CRISPR单元中作为新的间隔序列。然后将CRISPR单元转录为长RNA片段pre-crRNA.Csy4酶在每个重复元件中切割这个pre-crRNA，产生约60个核苷酸长的crRNA，其中含有与外源DNA部分匹配的序列.Cas蛋白将使用这些匹配序列将crRNA与入侵结合。病毒或质粒并使其沉默。“

Haurwitz说，用于在原核生物中沉默外源DNA的CRISPR / cas系统类似于短干扰或siRNA在真核生物中纠正遗传问题的方式。随着时间的推移，CRISPR / cas系统将通过相同类型的病毒和质粒建立可遗传的DNA编码免疫力，以防止未来的入侵。

由于Csy4酶的晶体结构模型与其同源RNA结合，其特征在于具有1.8埃的分辨率，Berkeley CRISPR研究团队已经证明Csy4在CRISPR RNA重复茎环的主要沟槽中产生序列特异性相互作用。与磷酸骨架的静电接触一起，这些相互作用使得Csy4能够使用活性位点中氨基酸丝氨酸和组氨酸的系统发育保守残基选择性地结合并切割前crRNA。

“我们的模型解释了大量CRISPR特异性内切核糖核酸酶的序列和结构特异性加工，”Doudna说。

Doudna和她的同事利用伯克利实验室高级光源(ALS)的Beamlines 8.2.1和8.3.1的实验终端站制作了1.8埃的分辨率晶体结构。两条光束线都由超导弯曲磁铁 - “超弯” - 提供动力，并且都具有最先进的多波长异常衍射(MAD)和大分子晶体学(MX)功能。Beamline 8.2.1是包含伯克利结构生物学中心的蛋白质结晶学束线的一部分。

“ALS及其蛋白质晶体学束线仍然是我们研究的重要资源，”Doudna说。

CRISPR / cas系统用于外源DNA的靶向干扰的crRNA加入了越来越多的小RNA分子，其介导真核生物和原核生物中的多种过程。了解这些小RNA分子的工作原理可以提高我们对细胞生物学的基本认识，并为RNA在生命进化中的基础作用提供重要线索。

Doudna说：“通过调查细菌是如何产生和使用小RNA进行选择性基因打靶的，我们希望深入了解细菌世界和真核生物世界中已经证明在遗传控制中具有进化实用性的途径的基本特征。现在看来，细菌和真核生物已经进化出了完全不同的途径，RNA被用于基因调控，这真是太神奇了!“

这项工作部分得到了国家科学基金会和比尔和梅林达盖茨基金会的资助。