数十年来，研究人员一直在使用“荧光原位杂交”(FISH)分析，以便在其巨大的核酸分子海洋中捕获完整细胞和组织中的特定DNA和RNA序列。由于它能够在显微镜下在它们所在的确切位置点亮特定序列，因此FISH已经成为诊断染色体异常，研究细胞核中基因组三维组织的首选方法，分析基因表达的直接产物，称为信使RNA等。

然而，采用罕见的FISH序列仍然具有挑战性，特别是在发出非特异性背景荧光的厚组织中，并且在多重分析中同时检测多个目标。已经开发了几种可以放大较弱FISH信号的方法，但这些方法不容易定制，不能同时显现大量DNA或RNA靶分子，并且它们昂贵且难以使用。

来自哈佛大学Wyss生物启发工程研究所和哈佛医学院(HMS)的合作研究团队现已开发出“通过交换反应进行信号放大”(SABRE)，这是一种高度可编程且实用的方法，可显着提高灵敏度以及定制和多路复用FISH分析的能力。研究小组展示了SABRE在小鼠视网膜不同层的不同RNA和DNA靶标上扩增FISH信号，并同时在人类X染色体上可视化多达17个不同的靶区域。此外，他们使用SABRE作为鉴定控制特定类型视网膜神经元中表达的特定基因转录的基因组元件的有效工具。他们的研究发表在Nature Methods上。

“通过SABRE扩增的FISH分析及其灵敏度，多重潜力，实用性和成本效益，我们创造了一种方法来克服现有方法的关键局限，并为研究人员提供更广泛的分析，包括基础研究，以及生物标志物发现和治疗学的发展，“Wyss Institute核心教授彭寅博士说，他与Blavatnik研究所遗传学和神经科学的Bullard教授Constance Cepko博士一起通信了这项研究。在HMS和Brian Beliveau，博士，曾任尹氏集团的Damon Runyon博士后研究员，现任华盛顿大学西雅图基因组科学系助理教授。

Yin还是Wyss Institute分子机器人计划的联合负责人，哈佛医学院的系统生物学教授;Cepko还是霍华德休斯医学研究所的研究员和哈佛干细胞研究所的成员。

在SABRE，研究人员首先编写了以前由Yin的小组报道的“引物交换反应”(PER)方法，以在催化自折叠DNA发夹结构的帮助下合成较长的相同较短序列的多联体。这种工程化机制与天然存在的酶促机制具有相似性，该机制在染色体末端延伸“端粒”，具有相同的DNA重复序列，以保护它们免于降解，但可以在试管中进行。

然后通过短互补的手柄序列将PER产生的多联体与它们在固定细胞和组织中的靶DNA或RNA序列杂交，其中它们为接下来添加的短荧光寡核苷酸('成像剂')提供具有多个结合位点的支架。“与传统的FISH分析相比，SABER不仅可以将一种荧光染料分子与多种荧光染料分子结合到一个核酸靶上，这可以显着提高来自细胞内部信号的强度，我们甚至可以进一步提高通过在额外的杂交步骤中创建分支结构来扩增它，从现有的多联体的内部分支点生长出额外的多联体，“Jocelyn Kishi博士说道，该研究的共同第一作者和博士后研究员与Yin一起与Beliveau合作开发了SABER。“这开启了大量新机遇。”

“SABER使我们能够在FISH分析中将信号强度调整为特定RNA和DNA靶标的丰度和定位，并且由于多个靶标的多联体可以提前合成，SABRE为我们提供了标准化的探针组，可以很容易在不同的研究中生成和重复使用，“Beliveau说。“此外，通过反复清洗样品中与一组靶标互补的成像剂，并将它们替换为与我们称之为DNA-Exchange的过程中与其他靶标结合的成像剂，我们能够进一步多样化我们的方法。”

可区分荧光染料的光谱特征使研究人员只能通过常规荧光显微镜同时分析多达四个目标。使用DNA-Exchange，可以从样品中洗去一组成像器，并用不同的一个成像器替换成不同目标位置的PER产生的多联体，并且该过程可以重复多次。利用'Exchange-SABER'的多路复用潜力，该团队使用相同类型的显微设备一次性可视化人类X染色体的17个不同区域。

将SABER应用于厚组织，HMS的Constance Cepko小组证明了该方法在视网膜中的性能和实用性，该视网膜被组织成具有高度多样性的神经细胞类型的层。“我们以前对分离的视网膜组织应用单细胞测序，但无法使用所得到的标记同时在完整组织中鉴定出许多细胞类型，”Cepko博士后研究员Sylvain Lapan博士说。组。“通过提供标记转录本的多重检测，SABER允许我们关闭这个循环并为我们的分析添加空间维度。”

他们分析的关键是共同第一作者Emma West为该研究开发的方法，该方法基于细胞表面荧光染色，可以计算地将视网膜横截面中包含的所有细胞映射到特定位置。这使得团队能够将通过SABRE增强的FISH分析获得的单个信号分配给细胞占据的精确3D空间。“通过对细胞坐标和转录物位置进行建模，我们可以创建一个在单细胞水平定量的组织数字表示。这不仅可用于鉴定细胞类型，还可用于分析表型和引入的遗传元件的活性， “联合第一作者艾玛·韦斯特说，他是Cepko集团的研究生。

此外，该团队使用SABRE-FISH作为鉴定基因组元件的有效工具，称为增强子，可驱动特定视网膜细胞类型的基因表达。“我们将重组DNA构建体引入视网膜，其中这些元件分别与报告基因偶联，并通过SABRE-FISH分析来量化单细胞中构建体的拷贝数，以及报告基因的表达，我们能够将一种特异性增强子的活性与细胞类型特异性表达相关联，“拉潘说。

“SABRE-FISH的灵敏度和更简单，更便宜的工作流程使我们能够从我们操纵视网膜的实验中收集更多信息，以便了解控制其发育的监管网络，并评估我们基因治疗方法的有效性。眼科疾病，“Cepko说。“重要的是，这种方法有可能同样增强许多其他组织类型和器官的研究。”