结构生物学的一项基本原则是，一旦研究人员可以直接足够详细地观察大分子，就应该有可能了解其3D结构如何赋予其生物学功能。确实，许多科学进步都依赖于尽可能详细地直接观察我们周围的世界，并且越来越多的努力致力于可视化对人类疾病具有关键作用的生物成分的原子结构。核磁共振(NMR)光谱，X射线晶体学和低温电子显微镜(cryo-EM)是目前使用的三种主要结构生物学技术。在这三种方法中，cryo-EM已经成为确定大型动态复合物结构的当前“执行方法”，事实证明，其他方法很难获得这种结构。

Yip等人在《自然》中撰文。1和Nakane等。图2报告了通过使用称为单粒子冷冻EM的方法获得的最清晰的图像，这使得首次确定蛋白质中单个原子的位置成为可能。被其它基团报道突破也产生在冷冻电镜图像的分辨率显着改善3，4。最终，这些进展将帮助研究人员以前所未有的分辨率更好地了解蛋白质在健康和疾病中的工作方式，并有可能帮助设计更好的疗法。

尽管cryo-EM是一项已有数十年历史的技术，但由于一系列技术和算法方面的进步共同推动了该技术可获得的分辨率的显着提高，因此自2013年以来，它已引起了越来越多的关注(称为“分辨率革命”)5。

收集单粒子冰冻EM数据始于已应用于特殊样品网格的蛋白质样品。将其插入液态乙烷中，将其快速冻结并将蛋白质颗粒捕获在非晶冰薄膜中。通过施加电子束而获得的样品网格中单个粒子的二维图像在计算上取平均，以生成3D结构。2D图像令人难以置信的“嘈杂”，因为必须使用低剂量的电子以避免损坏对辐射敏感的生物样品。因此，这些图像历来不适合在原子的详细程度上确定结构。然而，自2013年以来所报告的进展已允许收集与使用X射线晶体学获得的数据相媲美的单粒子冷冻EM数据。

cryo-EM的分辨率革命继续前进6。Yip等。和Nakane等。利用技术改进来确定称为铁蛋白(在没有金属的情况下称为载铁蛋白)的稳定铁存储蛋白的结构，其分辨率约为1.2Ångströms。这些结构是迄今为止确定的最高分辨率的单粒子冷冻EM重建，并且数据的质量足以分辨载铁蛋白中的单个原子(图1)。仅仅十年前，这种空前的壮举还没有被认为可行。

Yip及其同事的成功依赖于硬件的进步，包括诸如球差校正器和采用一系列滤光片的单色仪装置之类的组件，以确保只有能量分布较窄的电子才能与样品相互作用，从而提高了分离度。最终的图像。Nakane和他的同事应用了另一种技术，一种冷场发射枪，它还产生能量分布较窄的电子，以及一种通过滤除与样品非生产性相互作用的电子来降低每个图像噪声的技术。此外，中根等。使用下一代高度灵敏的电子检测相机捕获数据。

除了分析载铁蛋白外，Nakane及其同事还获得了一种1.7-α分辨率的结构，该结构是γ-氨基丁酸A型(GABA A)受体的一种形式，该受体被设计成比人类常见形式更稳定。该受体是一种蛋白质复合物，存在于神经元的细胞膜中，是许多治疗方法的靶标。对于这样的生物样品，通过单颗粒冷冻EM获得如此高的分辨率几乎被认为是不可能的，与结构上刚性的分子如载铁蛋白相比，这种样品在结构迁移率方面表现出高水平的灵活性。结构揭示了GABA A的细节 以前从未见过的受体，提供了洞察力，例如，了解蛋白质核心中称为组胺的分子的结合。

Yip，Nakane及其各自的同事描述的低温电磁硬件的发展推动了单粒子低温电磁分辨率的重大进步。每个团队使用的硬件都解决了冷冻EM成像各个方面的问题，这些方面以前限制了可达到的分辨率。使用这些技术，增加的冷冻EM图像信噪比将扩展该技术的适用性。例如，这可能包括使用该技术确定异质样品的高分辨率结构，例如由膜蛋白或构象或组成变化的大分子复合物形成的样品。也许这些技术的融合将能够确定甚至超过1Å的分辨率的冷冻电磁结构。这一次似乎是几乎不可能完成的追求。

但是，这些技术代表了低温EM仪器的精英水平，由于购买和操作成本，目前对于大多数机构来说都是遥不可及的。展望未来，这些类型的进步将帮助我们更多地了解限制可达到的分辨率的因素，因此可能使设计更好的仪器成为可能。尽管这样的高分辨率结构并不是回答每个生物学问题所必需的，但此类硬件可以提供的额外细节将限制3D结构中的不准确性，并为理解生物学功能提供更好的平台。然而，对于大多数大分子而言，固有的结构灵活性和结构异质性可能将成为分辨率限制因素，而不管可用的仪器功能如何。对于这种不稳定的标本，新样品制备技术的应用以及数据收集通量的改进和算法的进步，将提供新的方法来探查这些复合物的构象态势。因此，尽管cryo-EM的分辨率革命可能已接近尾声，但未来几年仍在等待更多的革命，这将使这项技术更加强大，并适用于各种生物学问题的研究。